竹类资源化学利用研究——竹内生菌对铅污染的响应及修复技术研究

本研究将以竹类植物为研究对象，从铅污染的矿山的竹类植的竹叶、竹枝、竹鞭物和铅富集植物（加拿大蓬、龙葵和商陆等）的根茎叶中分离出超富集铅锌的共生菌，通过测序等分子生物学等方法，鉴定和划分共生菌的种类，再以盆栽实验，将筛选出的共生菌接种到竹幼苗上，通过非损伤微测技术来测定共生菌伴生的竹类植物与对照的活体根系对铅锌离子的吸收的情况，来分析两者之间的铅锌离子的流速情况，同时研究与质膜相关的基因，来探讨共生菌对寄主在吸收铅锌离子之间的分子机理作用。

（一）竹共生菌筛选

（1）收集三明市大田县与尤溪县和南平市矿区和矿山等铅污染的地区竹类植物，采集竹叶、竹枝、竹鞭和根际土壤，于无菌袋带回实验室。

（2）将采集回来竹叶、竹枝、竹鞭经过前处理后，利用ICP-MS机对竹类植物各部分及根际土壤中的铅含量进行检测，为下一步分离高铅耐性的共生菌提供理论基础。

（3）在含有不同浓度铅的培养基，将竹叶、竹枝、竹鞭等三部分来分离和筛选植物共生菌。

（4）收集铅超富集植物（加拿大蓬、龙葵和商陆等），跟竹相同的方法来来分离和筛选植物共生菌。

（5）提取培养所获得的内生菌基因组DNA，以基因组DNA为模板，用菌株16SrRNA基因的PCR扩增，将获得的PCR产物进行测序，确定内生菌的种类，并做系统进化树分析。

图14分离纯化内生菌     

      图15内生细菌革兰氏染色

图16 小飞蓬内生细菌DNA扩增产物琼脂糖凝胶电泳

图17 基于 16S rRNA 基因序列构建的小飞蓬内生细菌系统发育树

（二）共生菌接种

（1）将获得的共生菌在固体平板上进行扩大培养，将供试菌接种于LB液体培养基中进行培养并收拾菌体。

（2）将不同种类的竹种子，经消毒后置于无菌沙床上，选取萌芽一致的种子用菌体悬浮液浸泡4h，并以无菌生理盐水浸泡的处理作为对照（CK）。

（3）一个月后，收集长势良好竹幼苗置入无菌垤石的花盆中进行培养，并设置不同铅浓度梯度。

（4）3个月来检测竹内生菌侵染情况。

（三）竹幼苗体内铅离子含量测定

采取生长优良的马尾松幼苗的不同部位，即根、茎和松针三部分，进行微波消解处理，完全消除有机质后将处理后的样品用二次蒸馏水定容10ml后，上ICP-MS机检测铅离子浓度。

（四）竹富集铅的分子机理研究：提取竹幼苗的总RNA，反转录成cDNA，对ABC转运蛋白家族基因，P-type ATPase，钙调素结合蛋白基因的扩增，目的片段连接转化，重组质粒的PCR检测与测序。设计荧光定量PCR的内参扩增引物，上荧光定量PCR机进行分析检测。

（五）富铅离子竹种培育：选择福建省三明市大田县，尤溪县，南平市等地的铅污染的矿区或者矿区种植接种过共生菌的富铅竹种100株，以测试竹种的富铅能力。